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步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司
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步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司
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步琦SFC系統(tǒng)
純化利多卡因與乙酰氨基酚
SFC應(yīng)用
1
簡(jiǎn)介
藥物是一種由化學(xué)或生物來(lái)源制成的產(chǎn)品，用于人類(lèi)或動(dòng)物的醫(yī)療治療，這些藥物往往以化學(xué)合成的形式來(lái)生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成是一種通常伴隨著雜質(zhì)存在的過(guò)程，因?yàn)楫a(chǎn)率很少是 100%。這些雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的療效、安全性和質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。因此，對(duì)藥物進(jìn)行純化以確保合成化合物的純度和完整性是至關(guān)重要的，藥物的純化可以通過(guò)色譜法等多種方法進(jìn)行。
最近，超臨界流體色譜（SFC）已經(jīng)作為一種替代反相液相色譜（RP-HPLC）的方法出現(xiàn)。SFC 使用超臨界二氧化碳作為流動(dòng)相的一部分，這是一種清潔且環(huán)保的溶劑，很容易從最終產(chǎn)品中去除。此外，SFC 結(jié)合了氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，在提供高分辨率的同時(shí)也能以更快的速度分離樣品。
在 SFC 的方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，最大的難點(diǎn)在于沒(méi)有一種通用的固定相。因此需要在不同的固定相上進(jìn)行篩選，以確定要分離的樣品的最佳選擇性。CO2 的低極性溶劑特性允許在色譜柱篩選時(shí)同時(shí)考慮非極性和強(qiáng)極性的固定相。在確定最佳固定相后，就可以進(jìn)一步放大到制備規(guī)格。
在本次應(yīng)用中，我們會(huì)例舉利多卡因和乙酰氨基酚的合成案例，利用 SFC 系統(tǒng)來(lái)高效去除合成過(guò)程中的雜質(zhì)，獲取高純度目標(biāo)化合物。在這一過(guò)程中，需要先進(jìn)行合適色譜柱的篩選，再放大至制備色譜的規(guī)格。
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設(shè)備
BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色譜系統(tǒng)
BUCHI Sepiatec SFC-50 超臨界制備色譜系統(tǒng)
BUCHI PrepPure 硅膠，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm
HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm
BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm
氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)
BUCHI PrepPure PEI，5um,250×10mm
BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×10mm
3
化學(xué)品與樣品
化學(xué)品：
二氧化碳 (99.9%)
甲醇 (≥99%)
甲醇溶液中2M的氨溶液
甲酸（99%）
去離子水
為了安全處理，請(qǐng)注意所有相應(yīng)的MSDS！
樣品：
乙酰氨基酚合成產(chǎn)物
利多卡因合成產(chǎn)物
4
程序設(shè)定
BUCHI Sepmatix 8x SFC平行色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×4.6mm
流速：3mL/min（每根色譜柱）
檢測(cè)：DAD 紫外掃描 200 nm - 600 nm
流動(dòng)相條件：
0?0.5min | 5%B |
0.5 – 8.0 min | 5 – 50 % B |
8.0 – 9.4 min | 50 % B |
9.4 – 9.5 min | 50 – 5 % B |
9.5 – 10 min | 5 % B |
篩選過(guò)程完全自動(dòng)運(yùn)行，流速設(shè)置為 3mL/min 每通道，使用流控單元，平衡每一根色譜柱。樣品自動(dòng)注入（V = 5 μL），并開(kāi)始平行篩選（運(yùn)行時(shí)間 =10min）。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 32℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
BUCHI Sepiatec SFC-50超臨界制備色譜系統(tǒng)
流動(dòng)相：A= 二氧化碳；B= 甲醇
柱尺寸：250×10mm
流動(dòng)相條件：等度運(yùn)行條件
檢測(cè)：紫外
所有 10mm ID 色譜柱都在預(yù)設(shè)流速下平衡 3 分鐘，使用自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，并開(kāi)始運(yùn)行。背壓調(diào)節(jié)器設(shè)置為 150 bar，柱子加熱至 40℃，可按需往改性劑中加入添加劑改善峰型。
5
結(jié)果
5.1 乙酰氨基酚
乙酰氨基酚（下稱(chēng) AA），也常被稱(chēng)為對(duì)乙酰氨基酚，是一種鎮(zhèn)痛劑、解熱劑和手性藥物。它屬于非阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛劑這一類(lèi)。在化學(xué)上，它可以通過(guò)對(duì)氨基苯酚（下稱(chēng) AP）與乙酸酐的反應(yīng)來(lái)合成，在此過(guò)程中發(fā)生 N-乙酰化（見(jiàn)圖1）。為了確定乙酰氨基酚合成產(chǎn)物的最佳純化分離固定相，首先進(jìn)行了柱篩選（見(jiàn)圖1）。
▲ 圖 1：頂部：乙酰氨基酚合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘。
圖1顯示，二醇基和 2-EP 相并未表現(xiàn)出分離度，硅膠相、CBD 相、氰基相和氨基相未顯示出理想的分離度，因?yàn)樗鼈儫o(wú)法實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離。HILIC 和 PEI 相具有良好的選擇性和分辨率，且分辨率始終遠(yuǎn)高于 1.5（見(jiàn)表1）。1.5 的分辨率意味著可以很好地分離 2 個(gè)峰。表1 還顯示了洗脫順序，氰基相顯示出相反的洗脫趨勢(shì)，對(duì)氨基苯酚先洗脫，然后是對(duì)乙酰氨基酚。篩選結(jié)果表明，反應(yīng)并非百分之百完全，因?yàn)楫a(chǎn)物中仍含有大量對(duì)氨基苯酚。
▲ 表1：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
選擇 PEI 相色譜柱放大至制備規(guī)格，因?yàn)樗哂凶罡叩姆直媛剩ㄒ?jiàn)圖2）。根據(jù)篩選時(shí)的色譜圖，我們可以確定 AA 和 AP 在甲醇為 35?40% 之間洗脫。圖2（頂部）顯示了在 40% 甲醇等度條件下，在 10 x 250mm 的PEI 色譜柱上對(duì) AA 進(jìn)行純化的情況，結(jié)果顯示 AA 和 AP 可以非常良好地分離。因此在相同的條件下，可以實(shí)施一個(gè)堆疊注射方法，用于自動(dòng)純化并收集 AA （見(jiàn)圖2，底部）。
▲ 圖2：?jiǎn)未巫⑸洌敳浚┖投询B注射（底部）用于AA的純化；運(yùn)行條件：流速=30 mL/min， 甲醇= 40 %，溫度 = 40 ℃，壓力BPR = 150 bar，注射 = 250 μL，UV波長(zhǎng) = 254 nm；堆疊注射條件：注射次數(shù) = 10，堆疊時(shí)間 = 1.8 min，F(xiàn)ractions = 1（基于時(shí)間的）。
5.2 利多卡因
利多卡因（下稱(chēng) L），化學(xué)名為 2-二乙基氨基 -N-(2,6-二甲基苯)乙酰胺，是一種用作局部麻醉劑和抗心律失常藥物的藥物，它作為鈉通道阻斷劑起作用。利多卡因可以通過(guò)兩步合成過(guò)程生產(chǎn)（見(jiàn)圖3）。第一步中，2,6-二甲基苯胺（下稱(chēng) X）的氨基組團(tuán)被?；?。第二步中，中間產(chǎn)物（下稱(chēng) IP）通過(guò)與二甲胺的親核取代反應(yīng)轉(zhuǎn)化為利多卡因。因此，需要進(jìn)行兩步純化過(guò)程。色譜柱篩選的結(jié)果如圖3所示，篩選過(guò)程中，在改性劑甲醇中始終添加 20 毫摩爾氨水作為堿性添加劑。
▲ 圖 3：頂部：利多卡因合成的反應(yīng)方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 儀器色譜柱篩選IP與利多卡因結(jié)果；從左到右：硅膠，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；運(yùn)行時(shí)間 = 10分鐘。
從結(jié)果來(lái)看，所有色譜柱都可用于中間體 IP 的第一步純化分離，因?yàn)槎季哂谢€(xiàn)分離的效果。其中氨基相具有最高的分辨率，且在甲醇比例較低時(shí)就能出峰（見(jiàn)圖3）。對(duì)于第二步利多卡因的純化，氰基和CBD相無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，而氨基再次表現(xiàn)出最佳的分離度（見(jiàn)表2）。在洗脫順序上，第一步中間體的純化出峰順序都是先 X 再 IP，而第二步的利多卡因的純化除了硅膠相之外都是先 L 再 IP（見(jiàn)表2）。
▲ 表2：樣品在不同固定相色譜柱條件下的分辨率值和洗脫順序
最終選擇 10 x 250mm 的氨基色譜柱進(jìn)行制備純化，因?yàn)樗姆直媛士偸亲罡叩模ㄒ?jiàn)表2）。氨基柱篩選結(jié)果顯示，X 和 IP 出峰時(shí)的甲醇比例約為 10 - 19%，L 和 IP 出峰時(shí)的甲醇比例約為 11 - 19%。圖 4 a) 顯示的是甲醇比例為 16% 等度條件下的 IP 的單次純化分離圖譜，圖 4 b) 顯示的是甲醇比例為 20% 等度條件下的 L 的單次純化分離圖譜。在相同的條件下，可以進(jìn)行疊層進(jìn)樣分離，分別自動(dòng)純化 IP 和 L，并進(jìn)行餾分收集（見(jiàn)圖 4 c) 和 d)）。
▲ 圖4：中間體 IP 的單次進(jìn)樣（a）和疊加進(jìn)樣（c）；運(yùn)行條件：流速 = 20 mL/min，改性劑 = 甲醇 + 20 mM 氨水，改性劑 % = 16 %，溫度 = 40 °C，壓力 BPR = 150 bar，進(jìn)樣量 = 170 μL，紫外波長(zhǎng) = 254 nm；疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 15，疊加時(shí)間 = 0. 75 min, Fractions = 1 (基于時(shí)間); 利多卡因L的單次進(jìn)樣 (b) 和疊加進(jìn)樣 (d) ; 運(yùn)行條件：流速 =20 mL/min, 改性劑 = 甲醇 + 20 mM 氨水, 改性劑 % = 20 %, 溫度 = 40 °C 和壓力 BPR = 150 bar, 進(jìn)樣 = 170 μL, 紫外波長(zhǎng) = 254 nm; 疊加進(jìn)樣條件：進(jìn)樣次數(shù) = 20, 疊加時(shí)間 = 0.65 min, Fractions = 1 (基于時(shí)間)。
6
結(jié)論
在進(jìn)行有機(jī)合成后，由于副反應(yīng)或轉(zhuǎn)化率未達(dá)到 100%，通常仍會(huì)存在雜質(zhì)，這些雜質(zhì)必須去除，尤其是在藥品生產(chǎn)中。
在藥物合成研發(fā)領(lǐng)域，時(shí)間與效率至關(guān)重要。BUCHI 的 SFC 色譜解決方案為研發(fā)人員提供了強(qiáng)大的工具，通過(guò) Sepmatix 8x SFC 色譜柱篩選系統(tǒng)與 Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)相結(jié)合，可快速篩選出合適的色譜柱并線(xiàn)性放大至制備規(guī)格。SFC-50 的疊層進(jìn)樣功能，不僅能實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守自動(dòng)分離，還可顯著提高分離效率，從而加快藥物合成研發(fā)的速度。
7
參考文獻(xiàn)
Medikamente & Medizinprodukte (admin.ch) (Status 23.11.2023).
PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.
Th. Eicher und H. J. Roth; Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).
The synthesis of Lidocaine (University of San Diego).
Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-pr?parativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).
Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).
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