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瑞士步琦
使用SFC分離西紅花主要提取物
SFC應用
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簡介
西紅花是世界上最昂貴的香料。雖然西紅花植物的花有一種精致的紫色色調，但它的絲狀紅色柱頭是高度珍貴的，因為它可以用作香料和天然染料。在秋天，柱頭被手工采摘并分離，以產生獨特的紅色香料。生產一磅（0.45公斤）的西紅花需要7萬朵花。
西紅花素、西紅花素的糖苷衍生物和微西紅花素是西紅花的顏色和味道的化合物。Safranal，一種單萜醛，也存在。此外，西紅花中還有一些化合物具有公認的藥理活性，如西紅花素衍生物和類黃酮。例如，西紅花類胡蘿卜素已被提出作為抗腫瘤的替代藥物，在將來可能單獨或與其他化合物聯(lián)合治療某些癌癥。
因此，有許多出版物在處理提取和分析西紅花的文獻。通常采用反相液相色譜（RP-LC）分離。典型的溶劑是水/乙腈或水/甲醇混合物。同往常一樣，固定相為C18。初始分離條件為高含水量，使用梯度法使有機溶劑含量隨時間顯著增加，以洗脫非極性化合物。甲酸常加到流動相中。
超臨界流體色譜（SFC）是一種使用超臨界二氧化碳（CO2）作為流動相的色譜方法。超臨界二氧化碳具有較高的擴散系數(shù)和較低的粘度，是分離和分析化合物的優(yōu)良溶劑。與其他類型的色譜法相比，SFC 提供了幾個優(yōu)點，包括更快的分析時間，更低的溶劑使用量和不同的選擇性。與 RP-LC 相比，SFC 是一種正交技術。
本應用說明介紹了用 SFC 和質譜聯(lián)用分離西紅花螺紋主要成分的方法。分析物的電離是通過電子噴霧電離（ESI）進行的。由于流動相由于使用 CO2 和甲醇而具有微酸性，因此不需要使用添加劑。
2
設備
Sepiatec SFC Instrument
Advion CMS detector
Nucleodur NH2 5 μm 250 x 4 mm
3
試劑和材料
二氧化碳（99.9%）
甲醇（≥99%）
西紅花線
4
實驗流程
樣品制備：
1000mg 西紅花用 10mL 熱甲醇提取 5 次。最終溶液經過過濾，用于天然化合物的分離。
實驗條件：
移動相 | A =二氧化碳；B =甲醇 |
移動相條件 | 0 - 1分鐘：14% B |
1 - 18分鐘 | 14 - 18% B |
18 - 40分鐘 | 18 - 50% B |
40 - 44分鐘 | 50% B |
檢測 | UV 440 nm MS ESI （+/-） |
在 86/14% 的超臨界二氧化碳和甲醇條件下，以 7 mL/min 的流速對 Nucleodur NH2 5 μm 250 × 4 mm 進行 5min 的平衡。使用自動進樣器進樣（V = 100 uL），開始運行（運行時間 =44 min）。背壓調節(jié)器設置為 150bar，柱箱加熱至 40°C。
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實驗結果和討論
▲ 圖1. 西紅花提取物純化后紫外色譜圖（紫外波長440 nm）
用甲醇對西紅花的主要成分進行了提取。由于甲醇是一種極性溶劑，因此會溶解一些極性化合物。圖1為 440 nm 處的紫外色譜圖。在前18分鐘，由于流動相（86 - 82% CO2）的非極性特性，沒有紫外線活性化合物洗脫。當流動相的極性通過梯度增加時，幾種極性化合物被洗脫。由于紫外檢測不允許對成分進行鑒定，因此SFC與MS耦合，可以連續(xù)鑒定。圖2為紫外和質譜圖。MS信號基于不同的質量：(b) mass 999 – 999.5 (ESI+); (c) mass 836.9 – 837.4 (ESI+); (d) mass 674.8 – 675.3 (ESI+); (e) mass 975.5 – 976 (ESI-); (f) mass 813.4 – 813.9 (ESI-); (g) mass 651.4 – 651.9 (ESI-) and (h) mass 341.2 – 341.7 (ESI-).
▲ 圖2. (a) UV- and (b – h) MS-Chromatograms of the purification of saffron extract; (b) mass 999 – 999.5 (ESI+); (c) mass 836.9 – 837.4 (ESI+); (d) mass 674.8 – 675.3 (ESI+); (e) mass 975.5 – 976 (ESI-); (f) mass 813.4 – 813.9 (ESI-); (g) mass 651.4 – 651.9 (ESI-) and (h) mass 341.2 – 341.7 (ESI-)
表1 為 圖2 中經質譜鑒定的主要化合物。在質譜分析中使用 ESI 電離分子，這是一種常壓下的溫和電離方法。電離可以在正電壓（ESI+）或負電壓（ESI-）下進行。在正離子模式下，通常會形成鈉加合物（[M+Na]+）或質子加合物（[M+H]+）。在負離子模式下，（[M-H]-）離子通常是由于失去一個質子而形成的。根據(jù)樣品及其性質的不同，也可以形成多種帶電產物。
西紅花素與幾種糖（葡萄糖、龍膽二糖、三甘糖和新波糖苷）結合形成西紅花素。西紅花素與糖分子的共價鍵導致極性的強烈增加，并使西紅花素具有親水性，這就是為什么在 AN 洗脫液中鑒定出的主要成分較晚。從 表1 中可以看出，西紅花絲線中存在西紅花素與龍膽糖和葡萄糖結合的情況。
復合克羅辛二硫代糖酯是由克羅辛和兩個龍膽糖分子組成的，這兩個分子是由 2 個 d -葡萄糖分子構建而成的。在 圖2 (b) 中，化合物被鑒定為正離子質量為 999 - 999.5。該加合物由鈉（質量 23g/mol）和樣品分子（質量 976.4g/mol）組成。對應的譜圖如 圖3 (a) 所示。在負電離電壓下也可以檢測到番薯素二糖糖酯（圖2 (e) 質量 975.5 - 976），對應的質譜圖如 圖3（b）所示。
在 ESI+ 模式（圖2(c)）和 ESI- 模式（圖2(f)）下，西紅花素根生物基糖基酯分別為（[M+Na]+ 質量 836.9 ~ 837.4）和（[M- h]- 質量 813.4 ~ 813.9）。對應的質譜圖如 圖3 (c) 和 (d) 所示。復方西紅花素-龍膽生物基糖基酯由西紅花素、龍膽糖和d -葡萄糖分子組成。
在 ESI+ 模式（圖2(d)）和 ESI- 模式（圖2(g)）下，西紅花素 gentiobiosyl 酯分別為（[M + Na]+ 質量 674.8 - 675.3）和（[M - H]- 質量 651.4 - 651.9）。對應的質譜如 圖3 (e) 和 (f) 所示。Crocetin 甲酯只能在 ESI- 模式下識別 (圖2（h) 質量 341.2 - 341.7 和 圖3(g)）。
在 ESI 過程中，樣品分子也是碎片化的，這就是為什么在圖2中，一些西紅花被分配到多個質量。例如，番石榴素二硫代糖酯可以電離成加合物（[M + Na]+）或（[M - H]-），但也可以進一步破碎。在負離子過程中，葡萄糖基團的去除導致片段的質量與西紅花素根生物基糖基酯和西紅花素根生物基酯相似。
▲ 表1. 質譜法鑒定的西紅花絲線主要成分的結構和分子量（圖2）。
化合物 1 在 ESI+ 和 ESI- 兩種模式下均進行了質量定向分餾，而化合物 2 只在 ESI+ 模式下進行了質量定向分餾?；衔?4 只能在 ESI- 模式下采集。然而，化合物 No.3 的提取質譜由于存在與化合物 No.1 和 2 結構相似的片段而變得復雜，從而干擾了質量導向分餾過程。為了解決這個問題，采用了一個額外的時間窗口。
▲ 圖3. 西紅花素二糖糖酯(a) ESI+和(b) ESI-，西紅花素根生物基糖基酯(c) ESI+和(d) ESI-，西紅花素根生物基酯(a) ESI+和(b) ESI-和(g)西紅花素甲酯ESI-的質譜
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實驗結論
在分析天然產物時，未知產物往往在提取過程中溶解。為了識別這些未知的成分，需要質譜分析。本研究采用甲醇提取西紅花線的主要成分，并采用 SFC-UV/MS 對其進行分析。用質譜法對其主要成分進行了連續(xù)鑒定。
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