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Flash和Prep液相色譜
上樣量選擇的理論基礎(chǔ)
Pure應(yīng)用
1
簡(jiǎn)介
在制備液相色譜中，樣品的上樣量是影響分離效果的重要因素之一。要純化分離的樣品應(yīng)以合適的濃度添加到色譜柱柱床上，以實(shí)現(xiàn)窄的水平譜帶。如果上樣量太大，則譜帶變寬，分離效率降低。
Flash和Prep HPLC的上樣量有很大不同。由于Flash色譜通常用于預(yù)純化，高分辨率不是優(yōu)先考慮的因素，因此上樣量往往比Prep HPLC高。在Prep HPLC中，主要目的是獲得最高純度的物質(zhì)，故基線必須得到分離。
正相和反相二氧化硅（如C-18、氨基或二醇基）的上樣量也存在相當(dāng)大的差異。由于非鍵合相二氧化硅的表面積大，故這種固定相的載樣能力更高。正相二氧化硅的載樣能力通常比鍵合二氧化硅的載樣量高約10倍。
標(biāo)準(zhǔn)二氧化硅（粒徑40-60 μm）通?？山邮?0%的載樣量；在使用較小顆粒（15-30μm）時(shí)可以達(dá)到30%。然而，重要的一點(diǎn)我們要知道，無(wú)論是反相還是正相，上樣量由樣品的復(fù)雜程度決定的。對(duì)于含有多種化合物的復(fù)雜樣品，決定其復(fù)雜性的因素是純化目標(biāo)化合物與其鄰近的洗脫組分的分離程度。通常情況下，復(fù)雜樣品需要少量多次的上樣方式來(lái)處理。
2
制備液相色譜上樣量選擇的理論基礎(chǔ)
在液相色譜中，樣品可以通過(guò)兩種不同的方式上樣：固體或液體。液體上樣，是將樣品溶解在溶劑中后，直接注入色譜柱上。固體上樣，是將粗樣品與載體材料（如硅膠）的固體均勻混合物放在色譜柱前面。
▲ 圖1：液體和固體樣品
每種技術(shù)都有其需要考慮的特殊方面，下面將進(jìn)行更詳細(xì)的討論。
3
液體上樣
液體上樣是一種將樣品很好地溶解在洗脫初始溶劑中的方法，可用于 Flash 和 Prep 液相色譜應(yīng)用中。推薦使用弱極性溶劑，因?yàn)閺?qiáng)極性溶劑會(huì)降低分離度。
液體上樣被認(rèn)為是最簡(jiǎn)單、最快捷的方法，但可能會(huì)造成樣品損失，需要考慮的因素如下：
化合物在初始溶劑中的溶解度:樣品需要完全溶解，因?yàn)檫M(jìn)樣系統(tǒng)或色譜柱頂部的沉淀可能在系統(tǒng)中產(chǎn)生過(guò)大的壓力，并最終導(dǎo)致樣品流失。
溶解溶劑的極性：如果使用極性溶劑溶解樣品，則它們可能會(huì)吸附在極性硅膠柱基質(zhì)上，并對(duì)更多極性化合物（后來(lái)在硅膠材料上洗脫的化合物）的分離產(chǎn)生不利影響。
樣品溶劑的體積:體積越大，樣品從一開(kāi)始就遷移到填料柱床中的風(fēng)險(xiǎn)就越高，從而導(dǎo)致譜帶變寬、分離度降低。理想的樣品體積不應(yīng)超過(guò)色譜柱體積的10%。樣品的保留率越高，可裝載的體積就越大。
樣品量：每根色譜柱都有規(guī)定的裝載量。理想的樣品量不應(yīng)超過(guò)純化柱的最大裝載量。
在 Flash 液相色譜中，通常是在注射器的幫助下將液體樣品手動(dòng)直接注入到色譜柱頂部（如下圖）。由于高背壓，無(wú)法在 Prep 液相色譜柱上進(jìn)行手動(dòng)上樣。
因此，它是通過(guò)專用的進(jìn)樣閥完成的，如圖所示：
▲ 圖2：Flash和Prep HPLC中的液體上樣
4
固體上樣
固體上樣是僅適用于 Flash 色譜分離應(yīng)用的技術(shù)，用于只能在強(qiáng)溶劑中溶解的樣品，或用于具有難以溶解的粘性或多雜質(zhì)樣品。該方法可以通過(guò)減少譜帶展寬和隨后的拖尾效應(yīng)來(lái)改善分辨率。一般來(lái)講，固體上樣分離較慢，但與液體上樣相比，分辨率更高。推薦的樣品量不應(yīng)超過(guò)色譜柱的最大載樣量。
固體上樣通常通過(guò)以下步驟完成：
將粗樣品溶解在合適的極性溶劑中。
然后，將該混合物在超聲浴中超聲幾分鐘，以提高溶解度。
過(guò)濾混合物以除去尚未完全溶解的物質(zhì)。
將硅膠以粗樣品重量的5倍添加到上述混合物中。
溶劑通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀完全地減壓蒸餾干。
最后，將粗樣品和硅膠的混合物裝入固體裝樣器中，然后將其安裝在色譜柱的前面。連接溶劑洗脫流路。
待分離的組分不斷地從固體裝樣器中洗脫到實(shí)際分離色譜柱中。
▲ 圖3：在Flash色譜分離中的固體上樣
支撐材料在固體上樣技術(shù)中起到至關(guān)重要的作用：吸收粗樣品，使洗脫的化合物能更好地轉(zhuǎn)移和分配。它還可以將樣品固定在適當(dāng)?shù)奈恢谩＿@對(duì)于具有挑戰(zhàn)性的樣品（如油性提取物）非常有利。
非鍵合的二氧化硅是最常用的吸附劑，但可能不是最佳的選擇。通常，建議使用與色譜柱相同類型的硅膠作為支撐材料。這樣可以避免不必要的化學(xué)相互作用或樣品的不可逆吸附。一種有用的替代材料是 Celithe,由于其中性的化學(xué)特性，它不與任何物質(zhì)發(fā)生相互作用。
5
結(jié)論
綜上所述，液體上樣和固體上樣各有優(yōu)劣、各有所長(zhǎng)，可根據(jù)樣品性質(zhì)和試驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇使用，差異化的操作來(lái)得到目標(biāo)純化合物。
表1：固體上樣和液體上樣的差異
技術(shù) | 優(yōu)勢(shì) | 劣勢(shì) |
液體上樣 | 快速、簡(jiǎn)單 | 分辨率較差 |
固體上樣 | 高分辨率 | 耗時(shí) |
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